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Metodología para el Cálculo del Porcentaje Tumoral
AstraZeneca
Grupo de expertos
Fco. Javier Freire Salinas
Laboratorio de Patología Molecular, Servicio de Anatomía Patológica del Hospital Universitario Marqués de Valdecilla.
Sofía del Carmen Martínez
Facultativo Especialista en Anatomía Patológica, Servicio de Anatomía Patológica del Hospital Universitario Marqués de Valdecilla.
Introducción
La llegada de los tratamientos personalizados a la oncología ha requerido un aumento exponencial en los test moleculares diagnósticos que se llevan a cabo en los laboratorios de patología. Es por esto, que los servicios de Anatomía Patológica se han convertido en un eslabón imprescindible en la medicina de precisión y de ellos depende la conservación y utilización con calidad y rigurosidad de las muestras tumorales. Junto a esta necesidad de tests, la creciente necesidad de cubrir grandes áreas genéticas ha generado la demanda del uso de tecnologías de análisis a gran escala como la secuenciación masiva paralela.
Aunque cada test utilizado en patología molecular tiene asociado parámetros concretos de sensibilidad, especificidad, requerimientos mínimos de celularidad y concentración de los ácidos nucleicos, todos tienen algo en común: la principal fuente de material genético es el tejido fijado en formol e incluido en parafina. Aunque el presente documento intenta presentar unas bases generales sobre el cálculo del porcentaje de celularidad tumoral, es de rigor recordar que la fase preanalítica es un proceso de vital importancia en la calidad de la “muestra molecular” obtenida1.
En relación con esta fase preanalítica, algunos aspectos han sido ampliamente analizados y debatidos, generándose multitud de guías (como las que se pueden encontrar en el proyecto SPIDIA*) son:
- el tiempo máximo de isquemia fría2
- el uso de formol tamponado2
- el tiempo de fijación formólica (diferente para muestra pequeñas y grandes)3
- la temperatura de fijación o
- el tipo de parafina utilizada4
Es importante conocer por qué ha de calcularse con precisión el porcentaje de celularidad tumoral a la hora de realizar un análisis molecular. Conocer con exactitud este parámetro nos permite aproximar la sensibilidad analítica de una técnica, es fácil entender que en ningún caso vamos a poder llegar a una sensibilidad de un 15% si no tenemos más del 10% de celularidad tumoral. Además, y sobre todo para tecnologías como la secuenciación masiva, saber la cantidad de células tumorales de la que partimos es imprescindible a la hora de calcular las alteraciones en el número de copias (CNV) ya que, en esta técnica, el cálculo de CNV se basa en la probabilidad de obtener un mayor o menor número de lecturas, al tener una amplificación o deleción con respecto a un control normal (figura 1).
Cálculo CNV: un ejemplo
Figura 1
Asumiendo que leemos una copia por cada alelo A) 100 células normales: 200 alelos, B) 100 células tumorales con CNV=3 300 alelos, C) si sólo tenemos 5% de celularidad tumoral y tenemos 300 alelos: CNV=22
Imágenes: El super villano del cuerpo humano. Mónica Lara Márquez. Saber Más: revista de divulgación, año 11, no. 62, marzo-abril
Es importante destacar que, tradicionalmente, en los servicios de Anatomía Patológica para la cuantificación de distintas técnicas (sobre todo las inmunohistoquímicas) se ha utilizado como parámetro un área tumoral marcada respecto al área total5. Sin embargo, para las técnicas moleculares esta aproximación no es válida. En el momento en el que requerimos utilizar ácidos nucleicos, es necesario saber con precisión con cuantos núcleos tumorales contamos con respecto del total de células del tejido (linfocitos, fibroblastos, células que forman parte de estructuras vasculares, etc.), ya que es sobre esa proporción sobre la que vamos a interrogar a la muestra.
Ejemplo de porcentaje de células tumorales
En la imagen 2 se puede visualizar un ejemplo claro de por qué el área tumoral no es un buen cuantificador cuando buscamos una extracción de ácidos nucleicos; en este ejemplo, estaríamos sobreestimando en más de un 40% el procentaje tumoral, con todos los errores analíticos posteriores que se desprendan de esta cuantificación.
Queda claro por tanto, que es necesario saber el número de células tumorales respecto al total de células, ya que son éstas las que pueden presentar las alteraciones buscadas mientras que el resto de células normales presentarían competencia con su ADN normal. Por el momento, la única manera es contarlas individualmente.
Se presentan a continuación, unas recomendaciones para facilitar este cálculo y para dilucidar la mejor muestra para los estudios moleculares.
- Ejemplos
- Resumen
- Conclusiones
- Casos
En bloques de tejido, si el tumor está predominantemente en una zona, es aconsejable seleccionar esa zona para realizar posteriormente macrodisección y calcular el porcentaje de células tumorales sobre esa zona.
En este caso de un bloque de tejido de un adenocarcinoma acinar prostático en una pieza de prostatectomía, seleccionamos la zona del cristal donde está localizado el tumor, evitando el parénquima prostático no tumoral, y calculamos en ella el porcentaje de células tumorales (en esta muestra observamos un 50% de núcleos de células tumorales en el área seleccionada).
En un bloque de tejido, si todo el bloque tiene representación de tumor, calcular el porcentaje de células tumorales en la totalidad de la laminilla.
En este caso de un bloque de tejido de un adenocarcinoma acinar prostático en una pieza de prostatectomía, no se podría seleccionar una zona con mayor representación de tumor, por lo que el cálculo se podría realizar en campos de toda la preparación (en esta muestra observamos un 70% de núcleos de células tumorales).
En biopsias pequeñas (broncoscopias, cilindros, BAG), si el tumor está predominantemente en una zona y se puede individualizar de manera sencilla para realizar macrodisección, seleccionar la zona y calcular el porcentaje de células tumorales sobre esa zona.
En este caso de un cilindro de próstata con un adenocarcinoma acinar, seleccionamos la zona del cristal donde está localizado predominantemente el tumor, evitando el parénquima prostático no tumoral, y calculamos en ella el porcentaje de células tumorales (en esta muestra observamos un 60% de núcleos de células tumorales en el área seleccionada).
En biopsias pequeñas (broncoscopias, cilindros, BAG), si no es posible realizar macrodisección, calcular el porcentaje de células tumorales sobre la totalidad de la muestra.
En este caso de una muestra obtenida por broncoscopia de un carcinoma de pulmón no microcítico, no se podría seleccionar una zona con mayor representación de tumor, por lo que el cálculo se realizaría en toda la preparación (en este caso, considerando el alto contenido en células inflamatorias de la muestra, observamos un 40% de núcleós de células tumorales).
En bloques celulares (citología), si el tumor está predominantemente en una zona y se puede individualizar de manera sencilla para realizar macrodisección, seleccionar la zona y calcular el porcentaje de células tumorales sobre esa zona.
En este caso de una PAAF ecoendoscópica de un adenocarcinoma de páncreas, seleccionamos la zona del cristal donde está localizado el tumor, evitando una zona hemática y con detritus ceulares y calculamos en ella el porcentaje de células tumorales (en este caso observamos un 70% de núcleos de células tumorales en el área seleccionada).
En bloques celulares (citología), si no es posible realizar macrodisección, calcular el porcentaje de células tumorales sobre la totalidad de la muestra.
En este caso de una PAAF transbronquial de un carcinoma de pulmón no microcítico, no se podría seleccionar una zona con mayor representación de tumor, por lo que el cálculo se realizaría en toda la preparación (en este caso observamos un 60% de núcleos de células tumorales, considerando el componente inflamatorio y estromal de la muestra).
- La estimación debe realizarse donde haya una mayor densidad de células tumorales viables y menor infiltrado inflamatorio.
- Debe estimarse el porcentaje de núcleos tumorales, no el área que ocupan las células.
- La estimación debe realizarse en deciles (10%, 20%, 30% …).
- Si todo el bloque tiene tumor, calcular el porcentaje de células tumorales en la totalidad de la laminilla.
- Si se selecciona un área donde la densidad de células tumorales es mayor, evitar en la medida de lo posible zonas de inflamación, necrosis, estroma desmoplásico o moco.
Extraido y modificado de Dufraing K, et al. Histopathology. 2019 Sep;75(3):312-319.
Dufraing K, van Krieken JH, De Hertogh G, Hoefler G, Oniscu A, Kuhlmann TP, et al. Neoplastic cell percentage estimation in tissue samples for molecular oncology: recommendations from a modified Delphi study. Histopathology. 2019 Sep;75(3):312-319. doi: 10.1111/his.13891. Epub 2019 Jul 18. PMID: 31054167
Se presenta en este escrito la necesidad de realizar una adecuada cuantificación del porcentaje de celularidad tumoral para un correcto análisis molecular. La exactitud en dicha cuantificación impacta de manera muy rotunda en la calidad, precisión y sensibilidad de los estudios moleculares, principalmente en técnicas como la secuenciación masiva.
El contaje ha de hacerse sobre el número de núcleos totales y nunca sobre el área total, y han de evitarse zonas de gran celularidad no neoplásica como los infiltrados inflamatorios.
Por último, la utilización de la macrodisección de zonas más representativas mejorará la eficiencia de la extracción y la calidad final de las técnicas utilizadas.
Como apunte práctico, se recomienda a los laboratorios disponer de una colección de materiales bien clasificados con los que formar al personal, tanto a patólogos como a personal en formación, biólogos moleculares y técnicos de laboratorio.
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% celularidad: 70%
Macrodisección: NO, tejido tumoral diseminado homogéneamente
Tumor primario: Próstata
Existe muy poco componente linfocitario. Quizá por área el porcentaje pueda parecer menor, pero el estroma es muy paucicelular y el componente artefactado es neoplásico y es preciso tenerlo en cuenta.
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% celularidad: 30%
Macrodisección: NO, tejido tumoral diseminado homogéneamente
Tumor primario: Próstata
Este caso, si fuese estimado por área ocupada por la neoplasia, tendría un porcentaje superior. Sin embargo, existen agregados linfocitarios y numerosas células inflamatorias diseminadas entre los nidos tumorales que disminuyen el porcentaje.
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% celularidad: 70%
Macrodisección: NO, tejido tumoral diseminado homogéneamente
Tumor primario: Sarcoma
Este caso pone de manifiesto la importancia de tener en cuenta el artefacto provocado por los instrumentos de toma de muestras y por el propio desarrollado por el tumor. En casos de tumores de células pequeñas, es conocido el artefacto de arrastre que impide observar la morfología celular, pero que debe ser tenido en cuenta a la hora de estimar el porcentaje de celularidad tumoral ya que contiene ácidos nucleicos de origen neoplásico.
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% celularidad: 70%
Macrodisección: SI, mejora el contenido tumoral
Tumor primario: Colon
En este adenocarcinoma de colon, si estimamos sobre el área total, podríamos obtener alrededor de 25-30%. Sin embargo, la presencia de un cierto contenido inflamatorio, junto a la gran extensión de hígado normal, y teniendo los nidos bien definidos, hacen muy recomendable la macrodisección7
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% celularidad: 30%
Macrodisección: NO, tejido tumoral diseminado homogéneamente
Tumor primario: Pulmón
Este caso muestra una gran superficie de corte ocupada por el carcinoma. Sin embargo, existe gran cantidad de celularidad linfocitaria diseminada entre los nidos neoplásicos, se observa un ganglio linfático en la zona inferior y contiene además una zona amplia de tejido adiposo que disminuye el porcentaje de celularidad.
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% celularidad: 60%
Macrodisección: SI, mejora el contenido tumoral
Tumor primario: Melanoma
Este es un ejemplo claro de macrodisección. Se trata de un melanoma cutáneo en el que se han incluido varios fragmentos de piel en el mismo bloque. Sólo uno de ellos contiene tejido neoplásico y es sencillo delimitar el nódulo con marcado sobre la laminilla y el bloque. Con este método incrementamos significativamente el porcentaje de células tumorales de manera sencilla.
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% celularidad: 70%
Macrodisección: SI, mejora el contenido tumoral
Tumor primario: Colon
Este es un caso donde, si incluimos la totalidad de la sección mostrada, el porcentaje es mucho más escaso del que puede indicar el área ocupada por tumor. Gran cantidad de tejido adiposo, mucosa normal adyacente y extensa reacción linfocitaria. Sin embargo, la buena delimitación del tumor hace posible la macrodisección y la selección de tejido tumoral, si bien no debemos olvidar intentar ser lo más estrictos y eliminar en la medida de lo posible el tejido linfoide acompañante. A veces es mejor perder algunas células tumorales para mejorar en porcentaje.
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% celularidad: 60%
Macrodisección: NO, tejido tumoral diseminado homogéneamente
Tumor primario: Vejiga
Se trata de una metástasis de un carcinoma urotelial en un ganglio linfático. Ha desaparecido prácticamente la celularidad linfocitaria. Existe un componente importante de necrosis, que en nuestro caso no es excesivamente problemático si no es posible prescindir de él. En este caso podríamos haber macrodisecado la zona para eliminarla, pero no fue necesario.
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% celularidad: 70% (depende de la precisión del corte, es bueno revisar con una HE posterior al corte)
Macrodisección: SI, mejora el contenido tumoral
Tumor primario: Melanoma
Caso de melanoma donde la macrodisección es sencilla y permite eliminar ADN no tumoral que disminuye el rendimiento de la NGS.
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% celularidad: 90%
Macrodisección: SI, mejora el contenido tumoral
Tumor primario: Próstata
Este caso de metástasis en un ganglio linfático por un adenocarcinoma prostático es un ejemplo de macrodisección que podríamos llamar negativa. Se observa un polo ganglionar linfoide conservado que añade muchísimas células no tumorales al análisis. Si eliminamos esta pequeña zona, prácticamente tenemos un 90% de celularidad neoplásica. Probablemente el análisis hubiera sido exitoso sin necesidad de eliminar esta zona, pero el porcentaje hubiera sido menor del 30%.
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% celularidad: 40%
Macrodisección: SI, mejora el contenido tumoral
Tumor primario: Pulmón
Este caso de adenocarcinoma pulmonar es complejo, ya que aunque hagamos macrodisección del tumor, podríamos pensar que por superficie, existe un gran componente de carcinoma. Sin embargo, el elevado contenido en linfocitos, con intento incluso de formación de folículos terciarios, disminuye el porcentaje de manera significativa.
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% celularidad: 30%
Macrodisección: SI, mejora el contenido tumoral
Tumor primario: Colon
Este caso de adenocarcinoma de colon hubiera sido imposible de analizar por NGS si no practicamos macrodisección. El componente tumoral es menor del 5% si incluimos toda la superficie. En este caso la irregularidad del corte y la correspondencia con el bloque hacen posible eliminar la práctica totalidad del tejido e incidir sobre los pequeños “picos” de tumor. Incluso con la presencia de células linfocitarias estimamos un 30% de celularidad tumoral.
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% celularidad: 70%
Macrodisección: SI, mejora el contenido tumoral
Tumor primario: Tiroides
Otro ejemplo cásico de importancia de la macrodisección. El carcinoma papilar de tiroides puede aparecer como en este caso, y la eliminación del componente no tumoral es fundamental para estimar el resultado de la NGS.
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% celularidad: 60%
Macrodisección: NO, tejido tumoral diseminado homogéneamente
Tumor primario: Próstata
Este caso de adenocarcinoma de próstata pone de manifiesto la importancia de examinar la totalidad de los fragmentos incluidos. Si vamos a analizar la totalidad, existen zonas de infiltrado linfocitario que pueden pasar desapercibidas y no ser tenidas en cuenta para el análisis.
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% celularidad: 30-50% depende de la propuesta de macrodisección
Macrodisección: SI, mejora el contenido tumoral
Tumor primario: Próstata
Metástasis ganglionares por adenocarcinoma de próstata. Sin lugar a dudas, si no existe un proceso de macrodisección el resultado de la NGS no será valorable. Son cuatro ganglios linfáticos con metástasis parciales. Deberíamos macrodisecar buscando las áreas metastásicas, o incluso eliminar la totalidad del componente ganglionar e incidir en la afectación de partes blandas, que prácticamente no muestra contaminación a pesar del artefacto celular. Propuesta 1: mayor densidad celular (hasta el 50%) pero mayor riesgo de contaminación con linfocitos Propuesta 2: menor cantidad y densidad celular (en torno al 30%), pero menor contaminación con DNA normal.
ADN: ácido desoxirribonucleico.
1. Fujii S, Yoshino T, Yamazaki K, Muro K, Yamaguchi K, Nishina T, et al. Histopathological factors affecting the extraction of high quality genomic DNA from tissue sections for next-generation sequencing. Biomed Rep. 2019 Oct;11(4):171-180. doi: 10.3892/br.2019.1235. Epub 2019 Aug 21. PMID: 31565223
2. Cree IA, Deans Z, Ligtenberg MJ, Normanno N, Edsjö A, Rouleau E, et al; European Society of Pathology Task Force on Quality Assurance in Molecular Pathology; Royal College of Pathologists. Guidance for laboratories performing molecular pathology for cancer patients. J Clin Pathol. 2014 Nov;67(11):923-31. doi: 10.1136/jclinpath-2014-202404. Epub 2014 Jul 10. PMID: 25012948.
3. Comănescu M, Arsene D, Ardeleanu C, Bussolati G. The mandate for a proper preservation in histopathological tissues. Rom J Morphol Embryol. 2012;53(2):233-42. PMID: 22732791.
4. Bussolati G, Annaratone L, Maletta F. The pre-analytical phase in surgical pathology. Recent Results Cancer Res. 2015;199:1-13. doi: 10.1007/978-3-319-13957-9_1. PMID: 25636424. *http://www.spidia.eu
5. Furukawa Y, Kimijima I I, Abe R. Immunohistochemical Image Analysis of Estrogen and Progesterone Receptors in Breast Cancer. Breast Cancer. 1998 Oct 25;5(4):375-380. doi: 10.1007/BF02967434. PMID: 11091678.
ES-35002 Febrero 2025
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